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小鼠血管舒緩激肽(BK)ELISA試劑盒實驗包被和封閉的原理
ELISA包被和封閉的原理:
實驗時,需要將抗原或捕獲抗體包被于固相載體上,通過檢測分子(酶或熒光基團),將化學(xué)信號轉(zhuǎn)換為電信號,以OD值或發(fā)光值的結(jié)果,對靶蛋白進行定量分析。
ELISA 中的固相載體物很多,常用的是聚苯乙烯,具有較強的蛋白質(zhì)吸附性。具有可制成各種形式,且不參與化學(xué)反應(yīng)的特點。與聚苯乙烯類似的塑料為聚氯乙烯,它質(zhì)軟板薄,可切割,價廉、但光潔度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高,但空白值有時也略高。除塑料制品外,固相酶免 疫測定的載體還有兩種材料:一是微孔濾膜;另一種載體是以含鐵的磁性微粒制作的。
在 ELISA 中,抗原和抗體的質(zhì)量是實驗是否成功的關(guān)鍵。ELISA 所用抗原有三個來源:天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原。天然抗原取材于動物組織或體液、微生物培養(yǎng)物等,一般含有多種抗原成分,需經(jīng)純化。重組抗原和多肽抗原均為人工合成品,使用安 全,而且純度高,干擾少的優(yōu)勢。但制備的技術(shù)難度較大,制備成本高。
將抗原或抗體固相化的過程稱為包被。因為載體的物質(zhì)不同,包被的方法也不同。如以聚苯乙烯 ELISA 板為載體時,需將抗原或抗體溶于緩沖液中,加于 ELISA 板孔中在 4℃ 過夜。如果包被液中的蛋白質(zhì)濃度過低,固相載體表面能被此蛋白質(zhì)完全覆蓋,后加入的血清標(biāo)本和酶結(jié)合物中的蛋白質(zhì)也會部分地吸附于固相載體表面,后產(chǎn)生非特異性顯色,導(dǎo)致本底值偏高。在這種情況下,需要在包被后用牛血清白蛋白再包被一次,消除干擾,這一過程也被稱為封閉。
通常包被和封閉都是在生產(chǎn)時由廠家完成的,只需要知道原理即可,實驗時無需操作。