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PCR反應(yīng)主要成份Taq DNA聚合酶分析
日期:2024-10-08 18:08
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摘要:
一般Taq DNA聚合酶活性半衰期為92.5℃ 130 min,95℃ 40 min, 97℃ 5 min?,F(xiàn)在人們又發(fā)現(xiàn)許多新的耐熱的DNA聚合酶,這些酶的活性在高溫下活性可維持更長時間。
Taq DNA聚合酶的酶活性單位定義為74℃下,30 min,摻入10 nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。Taq DNA聚合酶的一個致命弱點是它的出錯率,一般PCR中出錯率為2×10-4 核苷酸/每輪循環(huán),在利用PCR克隆和進行序列分析時尤應(yīng)注意.在100 μl PCR反應(yīng)中,1.5-2單位的Taq DNA聚合酶就足以進行30輪循環(huán)。
所用的酶量可根據(jù)DNA、引物及其它因素的變化進行適當(dāng)?shù)脑鰷p.酶量過多會...
一般Taq DNA聚合酶活性半衰期為92.5℃ 130 min,95℃ 40 min, 97℃ 5 min?,F(xiàn)在人們又發(fā)現(xiàn)許多新的耐熱的DNA聚合酶,這些酶的活性在高溫下活性可維持更長時間。
Taq DNA聚合酶的酶活性單位定義為74℃下,30 min,摻入10 nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。Taq DNA聚合酶的一個致命弱點是它的出錯率,一般PCR中出錯率為2×10-4 核苷酸/每輪循環(huán),在利用PCR克隆和進行序列分析時尤應(yīng)注意.在100 μl PCR反應(yīng)中,1.5-2單位的Taq DNA聚合酶就足以進行30輪循環(huán)。
所用的酶量可根據(jù)DNA、引物及其它因素的變化進行適當(dāng)?shù)脑鰷p.酶量過多會使產(chǎn)物非特異性增加,過少則使產(chǎn)量降低。
反應(yīng)結(jié)束后,如果需要利用這些產(chǎn)物進行下一步實驗,需要預(yù)先滅活Taq DNA聚合酶, 滅活Taq DNA聚合酶的方法有:
(1)PCR產(chǎn)物經(jīng)酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。
(2)加入10 mmol/L的EDTA螯合Mg2+ 。
(3) 99-100℃加熱10 min。目前已有直接純化PCR產(chǎn)物的Kit可用。